17 Июн Некультуральные методы диагностики грибковых кератитов
Грибковая инфекция глаз представляет собой одну из непростых проблем в современной офтальмологии, которая может привести не только к слепоте, но и к потере глаза как органа. На сегодняшний день описаны более 105 видов грибов, способных стать причиной развития офтальмомикозов, в том числе более 70 видов могут вызывать развитие грибковых кератитов Основными методами микробиологической диагностики в настоящее время остаются культуральные методы. Однако их недостатками являются длительность исследования, высокие требования к забору материала, повышенные требования к квалификации персонала лабораторий. В реальной клинической практике у врача, сталкивающегося с тяжелой инфекцией глаз, часто нет времени для ожидания результатов, ему требуются минимально затратные по времени методы диагностики для адекватного подбора этиотропной терапии. Бурное развитие молекулярной биологии и техники значительно расширило возможности диагностики инфекций глаз.
К основным некультуральным методам подтверждения диагноза грибкового кератита относятся прямая микроскопия образца, полученного с очага поражения, конфокальная микроскопия роговицы, современные молекулярные методы исследования. Ценным дополнительным методом диагностики может быть оптическая когерентная томография переднего отрезка глаза.
Прямая микроскопия
Самым быстрым методом выявления возбудителя в образце является метод прямой микроскопии с применением различных методов окраски. Полезными могут быть методы окрашивания Шифф-йодной кислотой и акридиновым оранжевым, модифицированный метод окраски по Цилю — Нильсену и др.
При микроскопии образца оцениваются вид мицелия, конидии (для грибов-конидиеносцев), гифы и их взаиморасположение с оплодотворяющими органами грибов. Основными сложностями данного метода являются неверная интерпретация результатов, наличие артефактов, редкое выявление грибов рода Candida и других дрожжеподобных грибов.
Основными материалами, служащими источником для прямой микроскопии, являются:
— стерильный материал на ватном тампоне или мазок, собранный посредством оттиска кальциевой альгинатной массой, с конъюнктивы и век обоих глаз.
— соскоб с роговицы, собранный с помощью шпателя Kimura, лезвием Bard — Parker, стерильным бритвенным лезвием, хирургическими лезвием или шпателем. Материал собирают с основания и краев язвы;
— контактные линзы, контейнеры для линз и многофункциональный раствор для линз.
— материал роговицы, полученный при выполнении сквозной или послойной кератопластики.
— биоптат роговицы.
Биопсия роговицы может быть эффективнее соскобов при глубоком расположении инфильтрата в строме роговицы и отсутствии обширного эпителиального дефекта.
Чувствительность и специфичность метода прямой микроскопии достигают 90%.
Оптическая когерентная томография (ОКТ)
(ОКТ) является современным методом визуализации переднего отрезка глаза. С помощью ОКТ можно проанализировать морфологию нормальной и пораженной инфекцией роговицы. Метод является неинвазивным, что позволяет использовать его не только для постановки диагноза, но и для наблюдения за состоянием роговицы в динамике.
В исследовании Y. Takezawa et al. (2017) было показано, что у большинства пациентов с грибковым кератитом наблюдается шероховатая линия раздела между задним эпителием и наложениями на нем, тогда как для бактериальных кератитов характерна четкая граница раздела эндотелий — преципитаты, что может служить дополнительным маркером при определении этиологии заболевания. Стромальные инфильтраты на ОКТ визуализируются гиперрефлексивными зонами в строме. Отек проявляется в виде диффузного утолщения стромы роговицы. Метод ОКТ позволяет осуществлять контроль за толщиной роговицы в случае ее изъязвления или развития стромального отека.
Конфокальная микроскопия (КМ)
(КМ) является методом диагностики in vivo, который позволяет исследовать передний сегмент глаза на различных уровнях и при различном масштабировании (возможно увеличение в 200—500 раз). Неинвазивность процедуры позволяет проводить повторные исследования для контроля лечения и оценки динамики заболевания.
Кроме грибковых частиц при помощи КМ можно выявить нервные волокна роговицы и оценить их состояние.
Молекулярные методы диагностики
к ним относятся — полимеразная цепная реакция ПЦР и масс-спектрометрия. Несомненными преимуществами данных методов являются оперативность и высокая точность получения информации об инфекционном агенте.
ПЦР- метод обнаружения компонентов ДНК инфекционного агента в образце ткани. ПЦР представляет собой ферментативную амплификацию участка ДНК.
ПЦР-диагностика является быстрым методом диагностики, т. к. требует всего 2,5 ч для получения достоверного результата после извлечения ДНК из образца. Чувствительность метода 94%, специфичность — 64% . Материал для исследования: слеза, внутриглазная жидкость, «свежие» ткани глаза.
Масс-спектрометрия
Масс-спектрометрия является методом, позволяющим быстро идентифицировать и классифицировать микроорганизмы. В основе метода лежат получение масс-спектра рибосомальных белков исследуемого микроорганизма, являющихся высококонсервативными и видоспецифичными, и сравнение его с масс-спектрами, содержащимися в базе данных. Степень сходства выражается в относительных единицах, что позволяет сделать вывод о принадлежности микроорганизма к тому или иному виду.
Метод масс-спектрометрии является быстрым — результат может быть получен в течение 24 ч с момента взятия материала. Метод имеет высокую специфичность (97%) и высокую чувствительность.
На сегодняшний день в распоряжении врачей существует множество путей для оперативной идентификации грибковой инфекции. Тем не менее ни один из представленных методов не является эталонным, и их применение в широкой практике ограниченно.
При использовании единственного метода исследования можно предположить наличие лишь наиболее вероятного возбудителя заболевания. Для наиболее точной верификации предпочтительнее использовать комбинации различных методик в сочетании с традиционными культуральными методами диагностики. Проблема диагностики грибковой инфекции глаз требует дальнейших разработок и совершенствования.
Используемая литература:
Новости медицины и формации № 656 . 2018
«Некультуральные методы диагностики грибковых кератитов»
Бельская К.И., Обрубов А.С.